Введение рекомбинантной ДНК в клетку

К настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов.

Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.

Они обычно содержат один сайт рестрикции к какой-либо одной рестриктазе, несут два гена устойчивости к разным антибиотикам и имеют ослабленный контроль репликации.

Разрыв ДНК плазмиды в сайте рестрикции превращает ее в линейную молекулу. Если той же рестриктазой была разрезана и чужеродная ДНК для выделения нужного гена, то этот ген можно «сшить» с плазмидной ДНК по одинаковым «липким концам» (рис. 1).

Рис. 1. Плазмида-вектор с встроенной экзогенной ДНК

Полученная гибридная (или химерная) плазмида будет представлять собой рекомбинантную ДНК. Гибридная плазмида может существовать в бактериальной клетке долгое время.

Она реплицируется так же, как и исходная плазмида. Обычно встроенная чужеродная ДНК не влияет на свойства бактерий.

Единственные известные в природе эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. В генной инженерии были «сконструированы» особые плазмиды, способные существовать в клетках как бактерии E. coli, так и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этом случае один и тот же вектор может быть использован с двумя хозяевами.

Явление переноса генетической информации при помощи вирусов называется трансдукцией и встречается в живой природе.

В генной инженерии наиболее широко применяется фага. ДНК фага представляет собой линейную молекулу, поэтому один разрыв рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов.

Эти фрагменты сшивают с чужеродной ДНК, в результате чего образуется химерный фаг. Этот фаг должен пройти цикл литической инфекции для накопления достаточного количества встроенной ДНК.

В последнее время разработаны тонкие методы введения экзогенной ДНК в клетки-реципиенты при помощи микроинъекций. Экспрессия чужеродного генетического материала в клетке-реципиенте представлялась наиболее трудной задачей на заре становления генной инженерии.

Накопление необходимого количества ДНК, при использовании как вирусных, так и плазмидных векторов происходит в бактериальной клетке-хозяине.

Обычно эукариотические гены в бактериальной клетке не экспрессируются. Для преодоления этого барьера разработаны различные подходы.

Для этого используются специфические праймеры (затравки) длиной 18–20 нуклеотидов и термостойкие ДНК-полимеразы. ПЦР позволяет увеличить количество ДНК любого участка в сотни раз.

Для транскрипции эукариотического гена в бактериальной клетке он должен быть помещен под контроль бактериального промотора. Это достигается встраиванием либо кодирующей последовательности эукариотического гена в структуру оперона (причем рядом с промотором), либо бактериального промотора в вектор.

При трансформации эукариот посредством ДНК бактерий необходимо учитывать, что репликаторы бактериальной клетки в эукариотической клетке не работают.

Для преодоления этого барьера введенная ДНК должна быть интегрирована с хромосомой, что значительно легче осуществить у микроорганизмов.

Хорошую модель такого процесса мы можем наблюдать в природе. Было показано, что причиной опухолей некоторых растений является бактериальная Ti-плазмида длиной около 200 000 п. н.

Эти плазмиды проникают в клетки растений, часть ДНК Ti-плазмиды (Т-ДНК) встраивается в хромосомы растений и вызывает образование опухолей, нарушая баланс фитогормонов. С помощью Ti-плазмиды были проведены различные эксперименты на растениях .

В настоящее время многие барьеры, препятствующие первым исследованиям, преодолены. В бактериальном геноме экспрессируются введенные гены человека (инсулина, интерферона, гормона роста и др.). Успешно вводятся чужие гены, в том числе и человека, в геномы животных.

Животных, носителей такого гена, называют трансгенными. Генная инженерия породила целую новую индустрию – биотехнологию.